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集菌儀 如何用濾膜法測細菌總數(shù)

更新時間:2023-08-09  |  點擊率:816

集菌儀 如何用濾膜法測細菌總數(shù)

基于濾膜上細菌直接計數(shù)法的細菌總數(shù)快速檢測
【摘要】 細菌總數(shù)快速檢測在質(zhì)量監(jiān)測中具有重要的意義,目前除了經(jīng)典的平板培養(yǎng)法以外,還有微菌落法、阻抗法等快速檢測方法,這些方法或者需要較長的檢測時間,或者需要較高的檢測成本。本研究提出一種不需要培養(yǎng)而在濾膜上直接計數(shù)的細菌總數(shù)的快速檢測方法,它主要分為過濾、染色、顯微鏡計數(shù)和計算四個步驟。計算細菌總數(shù)時,根據(jù)細菌在濾膜上的分布特點,對傳統(tǒng)公式進行改進,提出按區(qū)域計算細菌總數(shù)的計算方法,提高了檢測精度。研究結(jié)果表明,該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異(t=0.847,P=0.436>0.05),是一種低成本、快速的細菌總數(shù)檢測方法。
1 引 言
細菌總數(shù)計數(shù)的研究已有很多,目前國標規(guī)定的方法為平板計數(shù)法,該方法是將樣品加入瓊脂營養(yǎng)基,在37 ℃下培養(yǎng)24~48 h后計數(shù)。這種方法精度高,但耗時長,難以滿足實際工作需要。為了簡化檢測程序、縮短檢測時間,國內(nèi)外學(xué)者進行了大量的快速檢測方法的研究,提出了阻抗檢測法〔1〕、Simplate TM全平器計數(shù)法〔2〕、微菌落技術(shù)〔3-5〕、紙片法〔6-7〕等檢測方法,取得了的成果,但檢測時間仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基礎(chǔ)上,提出了在濾膜上染色后,直接計數(shù)的細菌總數(shù)檢測方法,具體步驟為:用集菌儀進行細菌收集→在膜上進行染色→在油鏡下計數(shù)→按公式計算出菌液濃度。實驗結(jié)果表明,該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異,檢測時間約1 h,是一種快速的細菌總數(shù)檢測方法。
2 材料與方法
2.1 材料
本研究中用的試驗材料有集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司),染色劑,生物顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司),聚碳酸脂膜(直徑47 mm)。
2.2 實驗方法
2.2.1 準備工作 卸下集菌儀的濾網(wǎng)(見圖1),統(tǒng)計濾網(wǎng)上小孔總數(shù),為計算菌液濃度做準備。另外,還需對集菌儀中的集菌器進行高壓滅菌,以防止過濾過程中引入外源細菌。
2.2.2 細菌收集 取濃度的霉菌菌液300~500 ml,裝在集菌儀上,集菌儀采用蠕動加壓方式對菌液施加的壓力,使菌液流過孔徑為0.45 um的聚碳酸脂膜。采用過濾方法是因為它可以使細菌相對均勻地分布在濾膜上,而選用聚碳酸脂膜是因為這種膜具有良好的透光性,便于用顯微鏡觀察。
2.2.3 染色 集菌后取下濾膜,切下一部分放在載玻片上,進行染色、固定。染色的目的是增大細菌與背景的對比度,便于觀察。
2.2.4 顯微鏡計數(shù)與計算 菌液經(jīng)集菌儀過濾后,細菌在濾膜上的分布見圖2、圖3,由圖可以看出細菌分布具有以下兩個特點:一是細菌集中在一個個的圓形區(qū)域內(nèi),這些圓形區(qū)域和擋板的小孔相對應(yīng);二是各個圓形區(qū)域之間細菌很少。根據(jù)膜上細菌分布的這種特點,提出以圓形區(qū)域為單位進行計數(shù),統(tǒng)計出圓形區(qū)域內(nèi)細菌的平均個數(shù),從而計算出菌液中細菌總數(shù)。具體步驟如下:隨機選擇10個圓形區(qū)域,在油鏡下,調(diào)節(jié)焦距以獲得較清晰的圖像(見圖4),統(tǒng)計每個圓形區(qū)域內(nèi)的細菌個數(shù),然后按公式(1)計算出菌液的濃度。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上細菌的區(qū)域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
圖3 膜上細菌的區(qū)域間隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖4 膜上細菌染色后圖像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式中:X表示待檢菌液濃度(CFU/ml)
A表示10個圓形區(qū)域內(nèi)細菌總數(shù)
N表示濾網(wǎng)上小孔總數(shù)
V表示集菌時所用待檢菌液體積(ml)
3 結(jié)果與討論
3.1 實驗結(jié)果
按上述方法計算得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法得到的結(jié)果見表1。表1 兩種方法得到的細菌總數(shù)
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5樣本6染色鏡檢
(cfu/ml)185168157165171166平板培養(yǎng)
(cfu/ml)176155165158183152
對表1中兩組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗,在α=0.05時,雙尾檢驗結(jié)果如下:t=0.847,P=0.436>0.05,說明兩種方法得到的結(jié)果無顯著性差異。
3.2 討論
3.2.1 計算公式的改進 用集菌儀對樣本菌液進行過濾時,由于濾網(wǎng)擋板的作用,使得細菌不是均勻地分布在整個濾膜上,而是集中分布在濾網(wǎng)的小孔處,所以,計算細菌總數(shù)時,不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V(其中Φ1,Φ2分別為濾膜直徑和視野直徑),該公式是微菌落方法檢測細菌總數(shù)中的常用計算公式。在本實驗中,根據(jù)細菌分布的特點,提出以圓形區(qū)域為單位計算細菌總數(shù)的思路,使計算結(jié)果更接近真實值,從而提高了檢測精度。
3.2.2 細菌大小的影響 細菌大小對本實驗的影響主要體現(xiàn)在鏡檢時,如果細菌太小,顯微鏡計數(shù)時不能將細菌從背景中分辨出來,我們的實驗結(jié)果顯示,不能分辨大腸桿菌和葡萄球菌,而較大的霉菌可以清晰地分辨。
3.2.3 檢測時間進一步縮短 細菌總數(shù)的經(jīng)典檢測方法是平板培養(yǎng)法,得到的結(jié)果精度高,但是它所用時間長,為了縮短檢測時間,出現(xiàn)了微菌落法,將檢測時間縮短為4 h左右〔3-5〕。本研究不對細菌進行培養(yǎng),而是在膜上染色后直接用顯微鏡計數(shù),大限度地縮短了檢測時間,使整個檢測時間在1 h左右。
4 結(jié)論
本研究用集菌儀將菌液過濾后,取濾膜一部分進行染色、制片,然后在油鏡下統(tǒng)計細菌個數(shù)。根據(jù)細菌在濾膜上的分布特點,提出將圓形區(qū)域作為統(tǒng)計單位,得到圓形區(qū)域內(nèi)細菌的平均個數(shù),從而計算出菌液濃度。實驗結(jié)果表明,按照該方法得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法的結(jié)果無顯著性差異。與平板培養(yǎng)法和微菌落法相比,該方法不需要細菌培養(yǎng),檢測時間只需要1 h左右,明顯縮短了檢測時間,是一種快速、有效的細菌總數(shù)檢測方法。

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